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「转载」基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统传递慢病毒载体的现状与展望
2021-12-08 03:50:00
CRISPR/Cas 技术通过提供对基因组序列的表达控制,完全改变了基因组编辑领域。慢病毒载体 (LV) 系统是 CRISPR/Cas 系统的主要载体之一,因为它能够携带庞大而复杂的转基因,感染分裂细胞和非分裂细胞。因此,为实现 CRISPR/Cas9 工具的有效和准确的基因到细胞转移,开发和优化的慢病毒载体系统是充分且必要的。今天我们主要给大家介绍下慢病毒载体和CRISPR/Cas9相关的基因编辑系统。
 
 
  基于HIV-1的病毒载体——基础生物学  
 
作为一种简单的逆转录病毒,HIV-1衍生的慢病毒(Lentivirus,LV)能够插入宿主基因组,感染分裂细胞和非分裂细胞。LV基因组约10.7 kb的单链RNA (ssRNA),包裹在一个富含脂质、直径约100 nm的球形衣壳中(图1)。慢病毒是一种包膜病毒,利用糖蛋白包膜附着并进入宿主细胞。慢病毒基因组包括结构基因gag、酶基因pol、包膜糖蛋白基因env、辅助基因nef、vif、vpr、vpu和调节蛋白基因tat、rev。其中,gag基因编码三种产物,即基质(MA)、衣壳(CA)和核蛋白(NC)。pol基因提供三种病毒酶,即逆转录酶(RT)、蛋白酶(PR)和整合酶(IN)。nef、vif、vpr、vpu四个基因参与病毒的进入,组装,复制,粒子形成和释放,在实际病毒生产过程中不是必需的。rev和tat基因,分别参与病毒的转录和输出。
 
图1 慢病毒载体的基因组和结构
 
基于病毒载体的安全性考虑,人们对慢病毒包装元件进行逐步改造:第一代包括所有辅助基因nef、vif、vpr、vpu和调节蛋白基因tat、rev以及rev的响应元件RRE。第二代去掉所有辅助基因,第三代去掉tat调节蛋白基因,第四代gag/pol基因与rev基因分别在不同的载体上,是迄今为止较安全的包装系统。
 
 图2 慢病毒生产包装系统的开发
 
  慢病毒的生命周期   
 
慢病毒的附着、结合和进入宿主是通过包膜蛋白与其受体之间的相互作用介导的。慢病毒进入宿主细胞,脱膜后暴露病毒RNA,开始在宿主细胞质中进行逆转录形成双链DNA(dsDNA),dsDNA进入细胞核后,一些dsDNA整合到宿主基因组中,病毒的dsDNA经过转录,会在细胞质中被翻译成慢病毒的结构蛋白和感兴趣的基因(如CRISPR/Cas9系统),最后病毒RNA和结构蛋白组装形成新的慢病毒。
 
 图3 慢病毒的生命周期
 
  基于CRISPR/ Cas9的基因编辑系统  
 
成簇的规则间隔短回文重复序列 (The Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated,Cas) 系统最近已发展成为在广泛的组织和器官中进行基因组和表观基因组编辑操作的革命性平台。在自然界中,CRISPR/Cas系统作为一种原核适应性免疫机制,识别、靶向并摧毁噬菌体和病毒的外源DNA和RNA。CRISPR/Cas系统非常多样化,到目前为止组成了6种Cas酶类型(I-VI),至少有30个亚型。迄今为止,研究和发展较多的CRISPR/Cas系统来自于II类Cas酶——Cas9。目前的CRISPR/ Cas9的基因编辑系统有两部分组成,sgRNA和Cas9。Cas9只有在一个特定的序列中才能与DNA结合,这个特定的序列被称为原间隔基序(PAM),PAM motif的识别使Watson-Crick RNA-DNA碱基配对成为可能。在RNA、DNA和Cas9之间的三元复合物组装后,核酸内切酶结构域变得活跃,并在两条DNA链内分裂,从而形成双链DNA断裂(DSB)。细胞修复有两种方法,一种是通过非同源端连接(non-homologous end joining, NHEJ)产生InDels。或者,提供一个dsDNA供体模板,通过同源重组(HDR)修复DSB,从而产生靶向插入。
 
 图4 CRISPR/ Cas9的基因编辑系统原理
 
  用于CRISPRi和CRISPRa  
 
  方法的Deactivated Cas9 (dCas9)  
 
Cas9核酸酶活性所必需的氨基酸残基位于RuvC和HNH结构域。研究证明,RuvC和HMH结构域的D10A和H840A突变能大大降低Cas9酶的催化活性,而不影响失活酶结合到目标DNA序列的能力。这种Cas9的突变被称为失活,没有核酸内切酶活性,被广泛用于转录和表观基因组研究。CRISPR激活 (CRISPR activation, CRISPRa):将dCas9与单个转录激活因子(如VP64)连接,dCas9-VP64融合蛋白在gRNA引导下,然后激活感兴趣的基因。CRISPR干扰 (CRISPR interference, CRISPRi) 将dCas9与转录抑制子(如KRAB)融合,结合到靶基因TSS位点,抑制转录起始,沉默靶基因的表达。基于dCas9特性,将dCas9与DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)的催化结构域连接在一起,应用于帕金森病患者的人诱导多能干细胞(hiPSC)来源的多巴胺能神经元,在位于SNCA内含子1的靶向DNA甲基化调控序列介导下,SNCA mRNA和蛋白水平出现稳定下调。该方法表明靶标序列结合LV-CRISPR-dCas9技术具有广泛的潜力,可以作为一种基于表观遗传学治疗帕金森病的新策略。
 
 
 图5 CRISPRi和CRISPRa的工作原理
 
  碱基编辑技术  
 
一般来说,与人类遗传病相关的最常见的遗传变异是点突变和功能性单核苷酸多态性(SNPs),因此,能够在单核苷酸水平上诱导稳健、高效和安全转化的基因编辑系统有可能治愈许多遗传性疾病。David Liu 团队构建的胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 系统是建立此类工具的第一个重要进展。其工作原理为改造过的Cas9(nCas9/dCas9)结合到靶基因上,胞嘧啶脱氨酶把PAM区上游大约5-6个活性窗口内所有胞嘧啶 (Cytosine, C)脱氨基变为尿嘧啶 (Uracil,U),在 DNA 复制过程中尿嘧啶变为胸腺嘧啶 (Thymine,T),产生的结果为碱基C变成了碱基T;同时,互补链上原来与C互补的鸟嘌呤(Guanine,G)会替换为腺嘌呤(Adenine,A),最终实现了C:G到T:A的单碱基准确编辑。与CBE系统类似,David Liu 团队将dCas9和腺嘌呤脱氨酶整合,在5-6个活性窗口内催化所有腺苷转化为肌苷,在DNA复制过程中将A:T碱基对转换为G:C碱基对,实现对基因组点突变的定点矫正修复。

 
 图6 碱基编辑器的工作原理
 
  先导编辑(Prime-Editing)技术  
 
与人类遗传疾病相关的大多数突变是碱基颠换,然而,根据ClinVar数据库,约40%的遗传疾病的救治需要将嘌呤基核苷酸转化为嘧啶基核苷酸,或者将嘧啶基核苷酸转化为嘌呤基核苷酸。最近,David Liu的团队最近开发了一种先导编辑器(PE)。PE由融合了DNA切口酶(如Cas9)的逆转录酶(RT)和一段特殊的向导RNA(prime editing guide RNA, pegRNA)组成。pegRNA的3’端序列具有两段序列:其一是作为引物结合位点(primer binding site, PBS),与断裂的靶DNA链3’末端互补以起始逆转录过程;另一则是作为逆转录的模板(RT模板),其上携带有目标点突变或插入缺失突变。PE的工作原理为:1)在pegRNA的引导下,Cas9切断含PAM的靶DNA链。2)断裂后的靶DNA链与pegRNA的引物结合位点(PBS)序列结合。3)逆转录酶沿RT模板序列开始逆转录反应。4)DNA链的切口处形成含有目的突变的3’flap和不含突变的5’flap结构,5)5’flap结构可以被细胞内核酸酶清除,6)经DNA连接和修复,最终实现靶基因的准确基因编辑。
 
 
 图7 先导编辑器的工作原理
 
  CRISPR/Cas9介导的慢病毒载体  
 
慢病毒载体由于其安全性和有效性,科学家设计并构建了同时表达Cas9和sgRNAs的慢病毒一体化载体。原则上,CRISPR/Cas9载体系统遵循与递送短发夹RNA (shRNA)相同的组织结构。这两个系统的表达通常由pol III启动子U6和H1驱动,并由pol III poly-A信号终止。相反,Cas9酶可以通过一个强普适的pol II启动子(如CMV和EF1-α)表达,也可以通过一个诱导对等体(如四环素调节启动子Ptet)表达,该启动子包含几个重复的tet-操纵子 (TetO)序列,这些序列位于最小启动子(如CMV启动子)的上游。CRISPR/Cas9介导的慢病毒载体被开发出来并用于治疗许多传染病,包括HIV-1、HBV和HSV-1,以及纠正潜在的人类遗传疾病,包括囊性纤维化和许多神经退行性疾病和紊乱。
 
  小结  
 
CRISPR/Cas技术已经完全改变了现代生命科学研究的各个方面,从基础科学到临床研究。重要的是,慢病毒载体的最新进展充分支持并使CRISPR/Cas工具能够强劲有效地传递到体内组织和感兴趣的器官,为以前无法想象的新方法和策略打开了大门。虽然这些创新技术和工具在不断进步,但也存在弊端。其中一个问题是,由于慢病毒提供的CRISPR/Cas9工具的永久表达,导致了相对较高水平的不良脱靶效应。除了在目标基因或区域之外引起不良影响外,整合慢病毒还有潜在的致癌性。为了充分解决这一问题,还需要进一步改进慢病毒载体。由于疾病进展是处于动态过程中,因此改善靶基因表达的空间和时间调节以实现更准确和微调的治疗非常重要。
 

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