单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 正在快速改变生物学的许多领域。众所周知，获得高质量的单细胞测序数据关键的步骤是获得高质量的单细胞悬液，高质量的单细胞悬液不仅仅是指高的细胞活性，还要保证细胞的状态不受影响，目前组织解离经常使用酶进行，需要根据组织类型在 37 °C 下孵育不同的时间育，但这可能会导致基因表达模式的人为变化，细胞内相关应激基因的高表达，失去起始取样时细胞的转录组状态，大大降低测序数据的准确性。近些年来，有不少研究者通过探索发现通过使用在低温条件下有解离活性的酶可以很好的消除37 °C 解离引起的偏差。

 

在2017年，Susanne C等表示在许多基因表达的研究中，单细胞是通过组织分离和荧光激活细胞分选(FACS)获得的，但研究中往往没有很好地描述这些方法对细胞转录组的影响，而且经常忽视这些影响。因此他们对采用广泛的解离方案获得的肌肉干细胞（SCs）进行了单细胞测序，同时对未解离的肌肉组织和解离后的细胞进行了单分子RNA荧光原位杂交(smFISH)分析。他们发现了一个细胞亚群，这个亚群在未解离组织中未检测到，但在使用两种不同解离方案获得的细胞中均检测到。这证实了解离方案对SCs的确有影响。另外，他们也在其他已发表的单细胞测序数据中检测到该亚型，这表明来自其它组织的细胞也可能受到这种伪迹的影响。

 

 

 通过两种方法证实广泛的解离方案会影响SCs的转录水平

 

( Susanne C van den Brink, et al,Nat Methods. 2017)

 

同年，Adam等的研究中描述了一种新的解离方法，该方法使用在寒冷中具有高活性的蛋白酶，从嗜冷微生物中纯化（喜马拉雅冰川常驻细菌地衣芽孢杆菌中分离的丝氨酸蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶 A）。整个过程在 6°C 或更低的温度下进行，在这个温度下，哺乳动物的转录机制基本上处于非活动状态，从而有效地“冻结”体内基因表达模式。为了测试这种方法，对来自小鼠肾脏的 20,424 个单细胞进行了测序，将嗜冷蛋白酶方法的结果与使用 37°C 孵育的程序进行了比较，结果显示冷蛋白酶方法解离可以得到与37°C 孵育方案相似的细胞分组，但37°C培养后，很多基因表达量很快发生了较大变化，例如Fosb，在37°C 孵育后表达量增加了1000倍以上，通过对表达变化的基因进行富集分析，显示显著的是与调节细胞死亡相关的通路，这表明冷蛋白酶方法大大减少了基因表达伪影。

 

Cold和37℃可以分离得到类似的细胞类型，但37℃会造成大量基因的表达量的变化

 

（Mike Adam, et al, Development. 2017） 

 

2019年，?O’Flanagan发现用冷活性蛋白酶解离实体瘤组织用于单细胞 RNA-seq 可较大限度地减少保守的胶原酶相关应激反应。研究中使用低温(6°C)蛋白酶和胶原酶(37°C)在不同的scRNA-seq数据集上识别与组织分离相关的基因转录水平，这些数据集包括来自患者癌症组织、患者源性乳腺癌异种移植和癌细胞系的155,165个细胞，观察到在不同条件和组织中细胞存活的标准质量控制指标有很大差异。从组织蛋白酶在37℃或6℃分解的对比中，发现胶原酶消化导致应激反应，获得了由胶原酶(37°C)诱导的512个热休克和应激反应基因(包括FOS和JUN)的核心基因集，通过用冷活性蛋白酶(6°C)分离将其较小化。

 

 

在37 °C下与胶原酶解离会在来自PDX样品的23,731个细胞中诱导明显的应激反应

 

而在6 °C下解离使这种反应较小化

 

（Ciara H. O’Flanagan, et al, Genome Biol. 2019）

 

近期Denisenko等通过使用两种组织分离肾脏组织方案（在 37 °C 下消化，称为温解离，或使用冷活性蛋白酶，称为冷解离）同样证实了前边研究者的结论，温暖的组织解离会引起与压力反应相关的实质性变化，即在冰上消化避免了在 37°C 解离时观察到的应激反应。

 

 

冷热组织解离方案的比较

 

（Elena Denisenko, et al, Genome Biol. 2020 Jun）

 

以上文献结果表明，采用低温解离方案能够有效的消除、降低由于37℃温育带来的“转录偏差”，提升数据质量，增强结果的准确性和可靠性，这个秘籍你掌握了吗？