2020 年诺贝尔化学奖授予 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna，因为他们开发了CRISPR/Cas9 基因编辑技术。

 

近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术发展的十分迅速，并且应用范围十分广泛。癌症是由肿瘤细胞的基因组变化引起的，CRISPR/Cas9可用于癌症研究领域，通过对癌症基因组进行编辑，探索肿瘤发生发展的机制。CRISPR/Cas9系统在癌症研究和治疗中得到越来越多的应用，并取得了显著的成果。本文主要介绍了基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统的机制和发展，并对该技术在肿瘤基础研究、诊断和治疗中的应用现状进行了综述。 
                                         

图片来源：https://doi.org/10.1186/s12943-021-01431-6
 

CRISPR/Cas系统具有设计简单、实施迅速、成本低、可扩展性强等优点，研究者认为它是一个革命性的基因编辑工具箱，已扩展到几乎所有基因组目标。特别是，该系统已广泛应用于癌症研究，并已成为一种潜在的癌症诊断和治疗方法。

研究表明，癌症是一种潜在的致命疾病，它积累了多个基因，并改变了整个基因组的表观遗传学。在过去的二十年中，高通量测序技术鉴定了大量与癌症发生和发展相关的基因。基于这些进展，基因编辑技术有望通过调节基因表达和纠正基因突变来治疗癌症。

1. CRISPR/Cas9 基因编辑工具的机制

CRISPR/Cas9系统是一种可遗传的原核生物适应性抗病毒免疫系统。它包含两个主要组成部分，一个Cas9内切酶，还有一个单链引导RNA (sgRNA)。sgRNA引导Cas9内切酶以序列特异性的方式切割目标基因的两条DNA链。DNA裂解发生在“NGG”原间隔邻近基序(PAM)上游的序列3’碱基对上。在切割后，基因组DNA通过双链断裂(DSB)修复机制修复。因此，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，通过相对容易出错的非同源端连接(NHEJ)或高保真同源定向修复(HDR)引入小的插入或删除(indels)来实现基因组编辑[1]。
 

 

CRISPR/Cas9基因编辑系统的机制

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2. CRISPR/Cas9 基因编辑工具的发展历程

“CRISPR”重复序列于1987年被报道，2002年被命名。2012年体外实验证明成熟的crRNA与tracrRNA通过碱基互补配对形成特殊的双链RNA结构，从而指导Cas9蛋白在目标 DNA 上引起双链断裂。2013年，Ⅱ型Cas系统应用于哺乳动物细胞DNA的切割，为CRISPR/Cas9系统应用于基因编辑铺平了道路。此后，CRISPR/Cas9 技术发展迅速，到 2020 年产生了几种基于 CRISPR/Cas9 的工具用于 DNA 和 RNA 水平的基因编辑。
 

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3. CRISPR/ cas9基因编辑工具在癌症基础研究中的应用

主要包含四个方面：

一：利用CRISPR/ cas9介导的敲除或敲入对功能基因进行鉴定和验证，包括癌基因、抑癌基因、化疗耐药基因、代谢相关基因和肿瘤干细胞相关基因。

二：利用CRISPR/Cas9文库筛选药物靶基因和功能基因。

三：CRISPR/Cas13系统在靶向并操作RNA中的应用。

四：利用体内生物素化的dCas9蛋白与gRNA可以进行相互作用研究，dCas9蛋白可与GFP等荧光标记物融合进行成像分析[2]。
 

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4. CRISPR/Cas9在癌症诊断中的应用

癌症的早期发现和治疗可以降低死亡率。基于CRISPR的诊断系统SHERLOCK和DETECTR可以用于检测癌症，SHERLOCK(特异性高灵敏度酶报告解锁)系统由RNA引导的RNase Cas13a(诱导非特异性单链DNA (ssDNA)反式切割)和RNA报告分子(RNA切割后释放)组成，在哺乳动物细胞中检测BRAF V600E和EGFR L858R的突变具有很高的敏感性[3]。另一个类似的系统名为DETECTR (DNA内切酶靶向CRISPR trans报告基因)，由Cas12a和重组酶聚合酶扩增(RPA)组成，用于筛查癌症中的病毒感染和放大微样本。该系统可以快速、廉价地检测感染多种不同类型HPV的样本中的高危HPV类型[4]。
 

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5. CRISPR/Cas9基因编辑工具在癌症治疗中的应用

利用CRISPR/Cas9在体外编辑免疫细胞，将CAR基因定向插入到特定的位置。它是一种准确的方法，可以长期杀死癌细胞，安全，提高T细胞的有效性，然后将这些细胞注射给患者以对抗癌症。Cyranoski等人进行了先进CRISPR人体试验，用CRISPR编辑的T细胞(敲除PD-1基因)治疗对化疗、放疗和其他治疗无效的转移性非小细胞肺癌患者，最近发表了一项近期的试验结果(NCT02793856)，证明了CRISPR基因编辑T细胞靶向PD-1的安全性和可行性[5]。还可以利用Cas9通过病毒基因组特异性Cas9-sgRNA消除致癌病毒。除此以外，利用CRISPR/Cas9基因编辑工具建立多基因突变的体内肿瘤模型，通过模拟人类癌症(异种移植)，既可用于基础肿瘤学研究，从功能上推断癌症基因，也可用于抗癌药物筛选[6]。快速准确的CRISPR/Cas9技术使研究人员能够通过特定的基因修饰创建癌症小鼠模型，从而对多步骤致癌过程进行更客观的研究。
 

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在短短几年时间里，CRISPR/Cas9作为一种稳定、高效、简单、广泛应用的基因编辑技术迅速出现并发展起来。CRISPR/Cas9已经从根本上影响了许多领域，如农业、生物技术和生物医学，但没有哪个领域比癌症研究受到的影响更深远。CRISPR/Cas9为肿瘤发生和发展机制的发现提供了更开阔的前景，更重要的是，CRISPR/cas9基因编辑技术为癌症治疗带来了巨大的希望。在该技术能够安全有效地应用于癌症的临床治疗之前，仍存在一些挑战。

 

 

参阅文献
[1] Zhang H, Qin C, An C, Zheng X, Wen S, Chen W, Liu X, Lv Z, Yang P, Xu W, Gao W, Wu Y. Application of the CRISPR/Cas9-based gene editing technique in basic research, diagnosis, and therapy of cancer. Mol Cancer. 2021 Oct 1;20(1):126.

[2] Zhou Y ,  Ping W ,  Feng T , et al. Painting a specific chromosome with CRISPR/Cas9 for live-cell imaging[J]. Cell Research, 2017, 27(2).

[3] Gootenberg J S ,  Abudayyeh O O ,  Lee J W , et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2[J]. Science, 2017, 356(6336):438-442.

[4] Chen J S ,  Ma E ,  Harrington L B , et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity[J]. Science, 2018, 360(6387):eaar6245.

[5] Cyranoski D . Chinese scientists to pioneer first human CRISPR trial[J]. Nature, 2016, 535(7613):476-477.

[6] Cyranoski D . CRISPR gene-editing tested in a person for the first time[J]. Nature, 2016, 539(7630):479.

[7] Lu Y ,  Xue J ,  Deng T , et al. Safety and feasibility of CRISPR-edited T cells in patients with refractory non-small-cell lung cancer[J]. Nature medicine, 2020, 26(5):1-9.

[8]Ting-Hin, Chen, Honglin, et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing of Epstein Barr virus in human cells[J]. The Journal of General Virology: A Federation of European Miorobiological Societies Journal, 2015, 96(Pt.3):626-636.

[9] Day C P ,  Merlino G ,  Van?Dyke T . Preclinical Mouse Cancer Models: A Maze of Opportunities and Challenges[J]. Cell, 2015, 163(1):39-53.